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CRISPR碱基编辑器“新星”ABE8e

比早期ABEs快1100倍

近日,CRISPR 基因编辑奠基人 Jennifer Doudna 在 Science 杂志发表了题为 DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor 的论文,首次解析了单碱基编辑器 ABE8e 的超高分辨率冷冻电镜结构,揭示了 ABE8e 如何实现 DNA 上的快速脱氨,为单碱基编辑技术的改进和安全应用提供了一条新的思路。

CRISPR碱基编辑器“新星”ABE8e

(来源:Science)

CRISPR/Cas 系统可以说是目前生物学界的“明星产品”。早在 30 年前,九州大学生物科学和生命技术部的 Yoshizumi Ishino 教授首次发现 CRISPR,但当时它的生物学功能还没有被人们所认识。

CRISPR 基因编辑器的早期发展史

2000 年初,阿利坎特大学免疫和生理部的 Francisco J M Mojica 教授带领的小组发现了 CRISPR 的间隔区与细菌病毒、古菌病毒和质粒的序列相似性,终于揭示了 CRISPR 作为免疫系统的功能。并于 2005 年由三个研究小组独立发表在刊物上。与此同时,他们还发现早前一些编码极端嗜热古菌特有 DNA 修复蛋白的基因与 CRISPR 有着强烈关联性,并将其命名为 cas (CRISPR-associated)基因。在当时,该发现的重要性显然为世人所低估。

比较基因组分析表明,CRISPR 和 Cas 蛋白 (cas 基因产物) 实际上是一起工作的,共同构成了一个获得性免疫系统,以保护原核细胞抵御入侵的病毒和质粒,类似于真核生物的 RNA 干扰 (RNAi) 系统 。因此,研究人员开始意识到,这可能成为一个非常强大的工具。

腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)是 DNA 的基本构成单元,按照 A-T、C-G 的配对形式搭建起了 DNA 的双螺旋结构。CRISPR-Cas9 碱基编辑器由 RNA 引导的 Cas 蛋白与一种脱氨酶融合而成。没有任何天然的酶让 DNA 中的腺嘌呤脱氨,因此,当天然的转移 RNA 脱氨酶融合到 Cas9 上,并进化出一种腺嘌呤碱基编辑器(ABE)时,基因编辑界就实现了全新的突破。

将基因组 DNA 中的 A-T 碱基对转换为 G-C 碱基对,将 C-G 碱基对转换为 T-A 碱基对,有望纠正人类约 60% 已知致病性单碱基变异。这种转换可以通过 CRISPR-Cas9 碱基编辑器,RNA 引导的 Cas 蛋白与单链 DNA(ssDNA)脱氨酶融合来实现。DNA 中的 A-T 到 G-C 转换需要将腺苷脱氨为肌苷,而肌苷被细胞机制识别为鸟苷(图 1,A 和 B)。在 DNA 没有脱氨基酶的情况下,大肠杆菌 tRNA 腺苷脱氨酶(TadA)与 Cas9 融合,并进化成 ABE7.10,它能催化脱氧腺苷的靶向脱氨 。

ABE7.10 编码两个 TadA 的副本,一个 N 端野生型(WT)TadA 连接到进化的 TadA(TadA-7.10),它的 C 端连接到一个 "缺口酶"[即切割双链 DNA(dsDNA)的一条链]版本的嗜热链球菌 Cas9(nSpCas9)(图 1C)。此后,ABE7.10 作为一种工具被广泛应用于许多细胞类型和生物体的基因组 DNA 的脱氨。研究人员还发现 ABE7.10 变体在细胞中催化非靶向 RNA 编辑,这种活性通过 TadA-7.10 域的突变或去除 N 端 WT TadA 域而降低,生成一个截短版的 miniABEmax(图 1.C)。

然而,无论是 ABE7.10 还是 miniABEmax,早期的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)效率都很低,运行也缓慢。待 ABE7.10 进一步发展以后,诞生了 ABE8e,它能编码单个 TadA 域(TadA-8e),并与 8 个测试的 Cas 效应器广泛兼容(图 1.C)。

CRISPR碱基编辑器“新星”ABE8e

图 1丨编辑器具体介绍(来源上述论文,Science)

ABE8e 究竟强在哪里?

为了了解腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)DNA 腺嘌呤脱氨的分子基础,亚利桑那州大学助理教授 Lapinaite 等人利用冷冻电子显微镜成像技术,以 3.2A 分辨率解析了 ABE8e 结合 DNA 时的 3D 结构,其中用于捕获催化构象的模拟物取代了目标腺嘌呤。这是人类首次观察到正在工作中的单碱基编辑器,也首次了解到融合后的 ABE 编辑器实际上仍然分相对独立的两个模块在工作,这让我们看清了 Cas9 融合蛋白的融合模式。

研究人员观察到,脱氨酶与 CRISPR/Cas9 R – 环复合物内暴露的 DNA 结合。动力学和结构数据表明,ABE8e 催化 DNA 脱氨的速度比早期的 ABEs 快约 1100 倍,因为突变使 DNA 底物稳定在一个受限的、类似转移 RNA 的构象中。此外,ABE8e 加速的 DNA 脱氨表明,在 CRISPR/Cas9 监控双链 DNA 的过程中,可能会发生以前未观察到的瞬时 DNA 融化。

ABE8e 的快速多转位反式 ssDNA 脱氨动力学研究显示,ssDNA 中的任何腺苷,包括那些被 Cas9 短暂暴露在溶剂中的腺苷,都可能被 TadA-8e 脱氨。为了探究这个想法,研究人员使用 dsDNA,其中 NTS 含有多个腺嘌呤,比较了 ABE7.10、miniABEmax 和 ABE8e 的体外编辑特性(图 2E),发现 ABE7.10 和 miniABEmax 主要是对单个 PAM – 端腺嘌呤进行脱氨,ABE8e 则是对多个腺嘌呤进行脱氨,包括存在于 R 环双链区域内的腺嘌呤(图 2E 和图 S10,A 和 B)。

CRISPR碱基编辑器“新星”ABE8e

图 2 丨动力学分析结果(来源 Science)

此外,ABE8e 的结构数据还阐明了新版本碱基编辑器速度更快的秘诀。研究人员发现,相比早期版本,新版本上有两个点突变,可以使蛋白质更紧密地抓住 DNA,从而更有效地把 A 替换为 G。

至此,我们终于明白了碱基编辑器 ABE8e 是如何在 DNA 上实现快速脱氨这一过程。这一实验结果有望为未来的碱基编辑器设计提供进一步的信息。

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